Jahrbuch der Baumpflege 2020. Группа авторов
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Standard PM 7/129 für die Diagnose von ALB ebenso geeignet wie für andere Bockkäfer und auch Schmetterlinge wie bspw. Blausieb (Zeuzera pyrina) und Weidenbohrer (Cossus cossus), die im befallenen Holz ganz ähnliche Symptome wie der ALB hinterlassen. Jedoch unterscheiden sich diese Arten morphologisch ohnehin so deutlich, dass bei ausreichend Larvenmaterial kaum eine Verwechslungsgefahr besteht (Abbildung 2).
Abbildung 2: A) Blausieb (Zeuzera pyrina) B) Weidenbohrer (Cossus cossus) C) ALB: Ei und Larve (kleines Fenster)
Bei Fraß und Nagespänen (Abbildung 3) sieht es anders aus, hier ist eine morphologische Bestimmung kritisch und eine molekularbiologische Diagnose wünschenswert bzw. dringend erforderlich.
Für den Fall, dass ein ALB-Verdacht ausschließlich auf morphologischen Symptomen an verletzten Bäumen beruht und keine ALB-Stadien verfügbar sind, haben wir eine neue Methode entwickelt, die den Nachweis von ALB aus Fraß oder Nagespänen ermöglicht, auch wenn sie nur winzige DNA-Mengen enthalten.
Abbildung 3: ALB in Ahornholz; Fraß und Nagespäne finden sich zuhauf, verpresst innerhalb der Larvengänge (A, B, D) oder unverpresst außerhalb des ursprünglichen Eingangsbereichs (C).
2.3 Probleme bei der ALB-Diagnose aus Holz
Die Extraktion von Insekten-DNA aus Holzmaterial impliziert die Anwesenheit von PCR-inhibierenden Substanzen wie Lignin und erfordert daher eine Anpassung des Protokolls zur Probenaufbereitung (SCHRADER et al. 2012). Um den PCR-inhibierenden Effekt zu minimieren, gibt es zwei Möglichkeiten: Entweder werden inhibierende Substanzen durch zusätzliche Reinigungsschritte während der DNA-Extraktion eliminiert oder es wird ein Polymerase Master Mix verwendet, der so robust ist, dass die Polymerase auch in Anwesenheit der Inhibitoren ihre Arbeit verrichten kann. Grundsätzlich ist es ratsam, schon während der DNA-Extraktion möglichst viele Inhibitoren zu beseitigen.
3 Material und Methoden
Im Rahmen des „ANOPLO-diag“-Projektes entwickeln wir ein Protokoll für neu designte Primer und Sonden für einen qPCR-basierten Diagnoseansatz. Im Zuge der Entwicklung eines sensitiven molekularbiologischen Nachweisverfahrens für ALB hat unser Projektpartner, die Analytik Jena AG, ein neues DNA-Extraktionskit (InnuPREP TCM DNA Extraction Kit) entwickelt, um holzbürtige Inhibitoren zu eliminieren. Darüber hinaus hat das Extraktionskit den Vorteil, das Ausgangsmaterial sofort in einem mitgelieferten, Metallkugeln enthaltenden Reaktionsgefäß mit Hilfe einer Labor-Kugelmühle (z. B. FastPrep-Homogenisator oder Schwingmühle) prozessieren zu können (Abbildung 4).
Abbildung 4: A) Metallkugeln enthaltende Reaktionsgefäße des InnuPREP TCM DNA Extraktionskits, B) Ausgangsmaterial, dem durch Gefriertrocknung das Wasser entzogen wurde, um die Aktivität DNA-abbauender Enzyme zu verhindern, C) Schwingmühle, die sich für die Homogenisierung größerer Mengen Ausgangsmaterial, aber auch für die Prozessierung kleiner Mengen in den InnuPREP TCM-Reaktionsgefäßen eignet.
Ein aufwändiges Mörsern unter Zugabe flüssigen Stickstoffs oder eine vorherige Gefriertrocknung der Probe sind nicht mehr erforderlich.
4 Ergebnisse
4.1 Warum eignen sich COI-Barcoding-Primer nicht zur Diagnose von ALB aus Nagespänen und Fraß?
Die COI-Barcoding Region umfasst eine Länge von 709 Basenpaaren. Oftmals ist die aus dem Holz extrahierte DNA jedoch zu kürzeren Fragmenten abgebaut bzw. de-generiert. Dies hat zur Folge, dass eine PCR negativ verläuft und keine Ziel-DNA amplifiziert wird. Wenn jedoch die Amplifikation von DNA des COI-Gens aus ALB-befallenem Holz gelingt, ist es andererseits möglich, dass sie nicht ausschließlich von ALB, sondern von verschiedenen eukaryotischen Organismen stammt, weil die im EPPO Standard PM 7/129-Protokoll empfohlenen Primer bspw. auch an die DNA von Pilzen und Oomyceten binden, mit denen ALB-besiedeltes Holz und ALB-Nagespäne häufig befallen sind (Abbildung 5A).
Abbildung 5: A) ALB-befallenes Holz mit Symptomen von Pilz- bzw. Oomyceten-Befall (Pfeile); B) Chromatogramme der DNA-Sequenzen, die unter Verwendung von Primern des EPPO Standards PM 7/129 erzielt wurden; C) Alignments von Primern LCO1490 und HCO2198 mit komplementären Regionen im COI-Gen von ALB und Pythium; SNPs sind farbig dargestellt.
Die Verwendung der Primer LCO1490 und HCO2198 des EPPO Standards PM 7/129 resultiert sehr häufig in unsauberen Chromatogrammen mit uneindeutigen DNA-Sequenzen, wenn ALB-Nagespäne als Ausgangsmaterial verwendet werden. Das Abgleichen (Blasten) der in Abbildung 5B gezeigten unsauberen Sequenz gegen Nukleotid-Datenbanken (bspw. Genbank) lieferte Pythium spp. (Oomycota) als besten „Hit“ (Datenbanktreffer). Sequenz-Vergleiche (Alignments) der Primer LCO1490 und HCO2198 mit komplementären Regionen im COI-Gen zeigen, dass die Primer des EPPO Standards PM 7/129 an ALB und Pythium-Sequenzen gleich gut (bzw. gleich schlecht) binden, da es in beiden Organismen dieselbe Anzahl an unstimmigen Nukleotiden (sogenannten SNPs) zu den Primern gibt. Will man ALB aus solch einer amplifizierten Misch-DNA zuverlässig nachweisen, muss die DNA von ALB aus dem Gemisch aufwendig isoliert werden (z. B. durch Klonierung), oder es müssen alle enthaltenen Organismen sequenziert werden (z. B. durch „Next Generation Sequencing, NGS“) (Abbildung 1). Beide Methoden sind jedoch zu aufwendig und vergleichsweise teuer.
4.2 Welche Ergebnisse sprechen dafür, dass unser Ansatz die Diagnose von ALB aus Nagespänen und Fraß ermöglicht?
Vergleichende Analysen mit Anoplophora chinensis (Citrusbockkäfer, kurz CLB; eng mit ALB verwandte Art) und anderen Insekten belegen, dass unser Protokoll hochspezifisch für den Nachweis des ALB ist. Der Vergleich von ALB-Nagespänen und Kontrollen sollte in etwa das in Abbildung 6 dargestellte Ergebnis liefern: gBlocks (synthetische Nukleotide) der ALB-Zielsequenz werden schon in frühen qPCR-Zyklen (links im Diagramm) nachgewiesen, Positivkontrollen aus Larven-DNA etwas später (weiter rechts im Diagramm) und Negativkontrollen gar nicht (Abbildung 6D). ALB-DNA aus Nagespänen ist gemäß dem Anteil enthaltener, noch nicht degradierter Kopien des Ziel-Gens entweder schon kurz nach den ALB-Positivkontrollen oder entsprechend später nachweisbar (Abbildung 6E). Natürlich kann nicht ausgeschlossen werden, dass die DNA in sehr alten Nagespänen so weit degradiert ist, dass überhaupt keine intakte Kopie der Ziel-Region mehr vorliegt.
Abbildung 6: Abwiegen genau definierter Mengen des Ausgangsmaterials (A), Verdünnungsreihen des Ausgangsmaterials zur