Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии. Коллектив авторов
Читать онлайн книгу.
на очевидное удобство этого способа, следует заметить, что оптимальное время обработки необходимо выверять для каждого используемого прибора отдельно, поскольку невозможно контролировать время прогрева сосуда с предметными стеклами до рабочей температуры, которое зависит от мощности и устройства конкретного прибора, а также от объема нагреваемой жидкости. Лучшей стандартизации можно добиться, помещая препараты в уже подогретый буфер, однако применение этого подхода делает методику более трудоемкой.
В патологоанатомической практике наибольшее применение находит демаскирование в скороварке (Bancroft J. D. [et al.], 2002). Для работы со скороваркой необходим достаточно большой объем буферного раствора (3 л буфера для скороварки вместимостью 5 л). Такие объемы делают процедуру достаточно дорогостоящей, если только буферный раствор не готовят самостоятельно сотрудники лаборатории.
Предметные стекла в металлическом держателе помещают на дно скороварки, закрывают крышку и начинают нагрев. Время обработки начинают отсчитывать после достижения рабочего давления. Для большинства антигенов оно составляет около 2 мин. Скороварка достаточного объема позволяет одновременно обрабатывать до 25 препаратов.
Следует заметить, что существуют антигены, которые разрушаются при тепловом демаскировании (например, эпитоп ламинина, выявляемый моноклональными мышиными антителами 4С7).
Для срезов, полученных с объектов, фиксированных в коагулирующих фиксаторах и в фиксирующих жидкостях сложного состава, эффект теплового демаскирования не столь очевиден, как для материала, фиксированного в формалине и цинк-формалине. В отдельных случаях использование высокочувствительных систем детекции позволяет обойтись без теплового демаскирования и получить результаты высокого качества с меньшими временными затратами. Если есть подозрение, что фиксация объектов производилась не в оптимальном режиме (длительная фиксация в растворе формалина, приготовленного «на глаз», и т. п.), обязательно тепловое демаскирование.
Эффективность процедуры теплового демаскирования антигенов удобно контролировать, параллельно с изучаемой серией предметных стекол производя обработку положительного контроля, в котором имеются пролиферирующие клетки (любой лимфатический узел и т. п.). После демаскирования на этом препарате необходимо поставить реакцию, выявляющую пролиферативный маркер – антиген Ki-67. Для его определения следует использовать моноклональные антитела MIB-1 (ткани человека) и MIB-5 (ткани крысы). В случае, когда демаскировка антигенов проведена неправильно, пролиферативные маркеры в положительном контроле не будут обнаружены. Наш опыт показывает, что для оценки эффективности демаскирования подходящим антигеном является виментин (Кирик О. В. [и др.], 2012). Особенно удобно использовать при этом моноклональные мышиные антитела клона V9 и учитывать эффективность демаскирования виментина в составе эндотелия