HPLC optimal einsetzen. Группа авторов
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auf MS-kompatible Bedingungen kostet dann meist unnötig Zeit. Viel praktischer wäre es, aus dem Chromatogramm der Trennung mit nicht MS-gängigem Phasensystem gezielt die Peaks zu isolieren, die man untersuchen möchte, und sie einem Eluentenwechsel zu unterziehen, bevor man sie in ein Massenspektrometer überführt. Dieser gar nicht so seltene Anwendungsfall gewinnt in jüngerer Zeit wieder mehr Aufmerksamkeit, nachdem sich vermehrt 2D-LC-Systeme etablieren, die dank moderner Softwareunterstützung deutlich einfacher zu bedienen sind als noch vor ein bis zwei Jahrzehnten. Abbildung 3.3 zeigt exemplarisch, wie ein relativ einfach gehaltener Aufbau eines sog. Single- oder Multi-Heartcut-Systems aussehen kann.
Abb. 3.3 (a) Single-Heartcut-Aufbau zur gezielten Isolierung eines unbekannten Peaks in einer ersten Dimension (1D column), „Parken“ dieser Substanz auf einer Trap-Säule (im unteren Ventil) bei gleichzeitigem Herabsetzen der Lösemittelstärke, und anschließender Elution über eine (optionale) zweite Trennsäule (2D column) ins Massenspektrometer; Pumpe 1D (unten) fördert den Eluenten der klassischen HPLC-Methode, Pumpe 2D die MS- kompatible mobile Phase; (b) Multi-Heartcut-Aufbau zum wiederholten Fraktionieren mittels Speicherschleifen (untere beiden Multipositionsventile) und anschließendem Transfer ins Massenspektrometer.
Eluiert die gesuchte Komponente in der ersten, nicht MS-kompatiblen Trenndimension, wird für die Zeitspanne der Elution das Peakvolumen durch das Schalt-ventil auf eine Anreicherungssäule (Trap-Säule) in einer zweiten Dimension umgeleitet. Während die restliche Trennung der ersten Dimension nach Zurückschalten des Ventils anschließend ungestört weiterläuft, kann in der zweiten Dimension, die mittels einer separaten LC-Pumpe MS-kompatibel an ein geeignetes Massenspektrometer gekoppelt ist, die auf der Trap-Säule geparkte Substanz, ggf. unterstützt durch eine Verringerung der Laufmittelstärke, frei von MS-inkompatiblen Zusätzen eluiert und per Massenspektrometrie weiter untersucht werden. Dieser Aufbau kann je nach Bedarf noch weiter professionalisiert werden. So ist nicht nur ein Lösemitteltausch denkbar, sondern eine echte 2D-Trennung, die es erlaubt, die Reinheit der geschnittenen Fraktion durch eine alternative/orthogonale Selektivität in der zweiten Dimension zu bestimmen und eventuell koeluierende Komponenten weiter aufzuschlüsseln. Auch ein mehrfaches Fraktionieren (Multi-Heartcut) einschließlich einer Quantifizierung in der zweiten Dimension ist mit geeigneten Erweiterungen dieses Aufbaus möglich. Dies im Detail zu beschreiben, überschreitet allerdings den Rahmen dieses Kapitels, weshalb auf weiterführende Literatur verwiesen wird [7].
3.4 Abkürzungen
| 2D | zweidimensional |
| APCI | Chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (engl. Atmospheric Pressure Chemical Ionization) |
| CDS | Chromatographiedatensystem |
| ESI | Elektrosprayionisierung (engl. electrospray ionization) |
| FIA | Fließinjektionsanalyse (engl. Flow Injection Analysis) |
| HPLC | Hochleistungsflüssigchromatographie (engl. High Performance Liquid Chromatography) |
| HR/AM | Hochauflösung/Exaktmassenmessung (engl. High Resolution/Accurate Mass) |
| ID | Innendurchmesser |
| LC | Flüssigchromatographie (engl. Liquid Chromatography) |
| MS | Massenspektrometrie |
| QC | Qualitätskontrolle (engl. Quality Control) |
| RP | Reversed Phase |
| SRM | Selected Reaction Monitoring |
| UHPLC | Ultrahochleistungsflüssigchromatographie (engl. Ultrahigh Performance Liquid Chromatography) |
| UV | Ultraviolett(e Strahlung) |
Literatur
1 Martin, M.M. (2017). Technische Aspekte und Fallstricke der LC-MS- Kopplung. in: Das HPLC-MS-Buch für Anwender (Hrsg. S. Kromidas). Weinheim: Wiley-VCH.
2 Martin, M.M. (2019). Der Gradient in LC-MS-Messungen. in: Der Gradient in der HPLC für Anwender: RP, LC-MS, Ionenanalytik, Biochromatographie, SFC, HILIC (Hrsg. S. Kromidas). Weinheim: Wiley-VCH.
3 Engelhardt, H. und Elgass, H. (1978). The Gradient Volume Principle for Fast Evaluation of Optimum Conditions for Isocratic Analysis. J. Chromatogr. 158: 249–259.
4 Dams, R., Benijts, T., Günther, W., Lambert, W. und De Leenheer, A. (2002). Influence of the eluent composition on the ionization efficiency for morphine of pneumatically assisted electrospray, atmospheric-pressure chemical ionization and sonic spray. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16: 1072–1077.
5 Hoffmann, T. und Martin, M.M. (2010). CE-ESI-MS/MS as a rapid screening tool for the comparison of protein–ligand interactions. Electrophoresis 31 (7): 1248–1255.
6 Meding, S. (2020). Quality control of oligonucleotides with a single quadrupole mass spectrometer, Thermo Fisher Scientific Technical Note 73670 [Online]. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Technical-Notes/tn-73670-lc-ms-oligonucleotides-single-quad-tn73670-en.pdf (Zugriff am 04. November 2021).
7 Grübner, M. und Greco, G. (2019). Flexible HPLC instrument setups for double usage as one heart-cut-2D-LC system or two independent 1D-LC systems, Thermo Fisher Scientific Technical Note 73298 [Online]. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Technical-Notes/tn-73298-hplc-1d-lc-or-heart-cut-2d-lc-tn73298-en.pdf, (Zugriff am 04. November 2021).
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