HPLC optimal einsetzen. Группа авторов
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Injektion übernimmt anschließend die Software. Beim Abarbeiten führt dann das CDS jede Injektion mit den spezifisch geänderten Quelleneinstellungen durch. Im Anschluss kann mit den Filterwerkzeugen von Chromeleon der erzeugte Datensatz nach den Trennungen mit den besten Resultaten, z. B. Anzahl der detektierten Peaks, maximales Signal-zu-Rauschen-Verhältnis oder anderen Kriterien, durchsucht und übersichtlich dargestellt werden. Auf diese Art kann mit einem vertretbaren Aufwand ein beliebig feingerasterter Satz an Detektionseinstellungen für eine Musterprobe automatisiert in Messungen verwendet und anschließend ausgewertet werden, um die am besten geeigneten HPLC- und MS-Einstellungen für ein gegebenes Trennproblem zu ermitteln [6].
Abb. 3.2 Beispiel einer automatisiert erstellten Sequenztabelle zur automatisierten Ermittlung von optimalen MS-Ionenquelleneinstellungen für ein Single-Quadrupol-Massen- spektrometer mithilfe von selbstdeklarierten Variablen (Custom Variables) in Thermo Scientific Chromeleon 7. Angewandt wurden diese Bedingungen zur Qualitätskontrollanalytik in der Herstellung synthetischer Oligonukleotide [6].
3.3 Übertragen von HPLC-Bestandsmethoden an die Massenspektrometrie
Solange im regulierten Umfeld noch zahlreiche HPLC-Methoden Anwendung finden, die zu einer Zeit entwickelt und validiert wurden, in der LC-MS-Kopplung noch keinesfalls zur Routine gehörte – die Pharmakopöen der USA, Europas und Chinas sind voll davon –, wird es für den LC-Analytiker zum Aufgabenspektrum gehören, etablierte Bestandsmethoden ganz oder teilweise MS-gängig zu machen. Die Beweggründe dafür können verschiedener Natur sein. Verschärfte regulatorische Anforderungen, zum Beispiel für den Nachweis genotoxischer Verunreinigungen, erfordern mitunter heute Nachweisgrenzen und eine Detektionsselektivität, die zum Zeitpunkt der Methodenentwicklung noch nicht zugänglich waren, jetzt aber mittels Massenspektrometrie zu leisten sind. Auch eine neuartige, unbekannte Verunreinigung, die bei einer Qualitätskontrollanalytik oder der Prozesskontrolle auffällt, erfordert in der Regel eine massenspektrometrische Untersuchung. Letzteres sollte bei lang etablierten Herstellprozessen in der Medikamentenherstellung zwar nur noch selten auftreten, da man einen seit Jahren oder Jahrzehnten bekannten Prozess vollumfänglich kennen sollte, aber selbst in der Generikaherstellung gibt es immer wieder die ein oder andere unliebsame Überraschung. Je nach Aufgabenstellung und Dringlichkeit lohnt es sich, die gesamte LC-Trennung auf eine LC-MS-Analytik umzustellen. Dies ist meist aber mit einigem Entwicklungs- und Validierungsaufwand verbunden und damit zeitaufwendig. Ist eine schnelle analytische Aussage im Rahmen einer Fehleranalyse gefragt, muss mitunter nicht die gesamte LC-Methode an ein Massenspektrometer gebracht werden, sofern man nur eine Untersuchung einer spezifischen (unbekannten) Komponente im Chromatogramm benötigt. In diesem Fall kann ein selektives Online-Fraktionieren der gesuchten Substanz mittels eines Heartcut-Ansatzes helfen, bei dem in einer zweiten Trenndimension das Laufmittel der Ausgangsmethode gegen eine MS-kompatible mobile Phase ausgetauscht wird.
3.3.1 Übertragung einer vollständigen HPLC-Methode an ein Massenspektrometer
Soll eine bestehende LC-Methode unter MS-gängigen Bedingungen wiederholt werden, gelten für die MS-Kompatibilität selbstverständlich dieselben Randbedingungen wie bei der Methodenneuentwicklung (siehe Abschn. 3.2.1.1). Je nach Alter der nicht MS-tauglichen Ausgangsmethode muss man dabei auf einige unliebsame Überraschungen gefasst sein. Dazu zählen:
• Typ und Entwicklungsgeneration der verwendeten stationären Phase:Ältere HPLC-Phasen stammen aus einer Zeit, in der die Stabilität der aufgebrachten stationären Phase noch nicht auf MS-Tauglichkeit hin optimiert wurde. Speziell RP-Phasen mit eingebetteten polaren Gruppen (je nach Hersteller polar-embedded group phases, Shield-Phasen oder ähnlich benannt) der ersten Generation, typischerweise in den späten 1990er- bis in den frühen 2000er-Jahren entwickelt, leiden unter einem vergleichsweise hohen Säulenbluten, welches im Massenspektrometer zu einem erhöhten Grundrauschen führt, das zudem mit dem Gradientenverlauf ansteigt. Echte Veteranen der klassischen C18-Phasenchemie, entwickelt ebenfalls vor über 20–25 Jahren, eluieren zudem mehr Metallionen als heutige Phasenmaterialien, was die Ionisierbarkeit der Analyten beeinträchtigt. Für die Identifikation einer unbekannten Substanz im „Feuerwehreinsatz“ mag das eine hinnehmbare Einschränkung sein, sofern die Komponente noch detektierbar bleibt. Für eine zu validierende LC-MS-Analytik ist dies kein gangbarer Weg, hier muss zu einer zeitgemäßen LC-Phase gegriffen werden. Erfahrungsgemäß erfüllen die meisten RP-Säulen, die in den 2010er-Jahren entwickelt wurden, alle Anforderungen an MS-Gängigkeit. HPLC-Säulen, deren Entwicklungsgeschichte bis in das letzte Jahrtausend zurückreicht und die bis heute in vielen tradierten Methoden im QC-Bereich noch Anwendung finden, empfehlen sich per se nicht zur LC-MS-Analytik.
• Veränderte Selektivitäten durch Verwendung MS-kompatibler Laufmittel:Wie in Abschn. 3.2.1.3 geschildert, sind viele herkömmliche HPLC-Additive und Puffer wegen ihrer geringen Flüchtigkeit nicht MS-kompatibel. Ein Austausch gegen leichtflüchtige Alternativen ist daher unvermeidlich, kann aber zu unerwünschten Änderungen in der Selektivität führen. Der Allroundpuffer der HPLC, das Phosphatsystem mit seinen drei Pufferpunkten bei (rund) pH 2, 7 und 12, ist sehr beliebt bei klassischen LC-Methoden, und nicht immer findet sich ein MS-gängiges Säure/Base-Gemisch, das im gleichen pH-Bereich wirklich puffert. Ein populäres Beispiel hierfür ist Ammoniumacetat, das mit seinen beiden pKs-Werten von 4,75 (Essigsäure/Acetat) und 9,2 (Ammonium/Ammoniak) bei pH 7 keine Pufferkapazität besitzt, sondern gerade dort besonders sensibel auf Änderungen des pH-Wertes reagiert. Darüber hinaus bestehen die meisten MS-kompatiblen Puffersysteme aus einwertigen Ionen (wie Triethylammonium, Ammonium, Formiat oder Acetat), während Phosphationen je nach pH-Wert zwei- bis dreiwertig vorliegen. Dies ändert bei gleicher Pufferkonzentration die Ionenstärke, was bei ionogenen Analyten (Säuren, Basen, Permanentionen) die Wechselwirkung mit polaren Oberflächen und damit die Retention beeinflussen kann. In beiden Fällen beobachtet man eine veränderte Selektivität gegenüber der Originalmethode, die zum teilweisen Verlust von Auflösung oder gar einem veränderten Elutionsmuster durch Peakumkehr führen kann. Es ist leider meist mehr die Regel als die Ausnahme, dass etablierte HPLC-Trennungen nach Umstellung auf MS-kompatible Laufmittel ein anderes Chromatogramm ergeben.
Diesen Phänomenen kann man mit einigen Anpassungen im Trennsystem begegnen, je nachdem, wie stark die Unterschiede zwischen der Original-LC-Trennung und dem MS-bedingt angepassten Trennsystem ausfallen. Manche Proben reagieren vergleichsweise wenig auf eine Änderung von mobiler und stationärer Phase, sodass ein Wechsel auf eine moderne stationäre Phase und die Übersetzung des Rezepts der mobilen Phase in die MS-Welt wenig Einfluss auf das Trennergebnis haben. Geringfügige Modifikationen der Laufmittelabmischung bzw. des Gradientenprogramms können dann verbleibende Schwachstellen wie eine nicht ganz optimale Basislinientrennung beheben, oder man schafft sich mit dem Massenspektrometer die Selektivität, die die LC-Trennung nicht mehr zu leisten vermag, z. B. mit Tandem-MS-Detektion. Gerade bei komplexeren Proben, die schon in der Ursprungsmethode kritische Peakpaare mit Auflösungen von RS < 2 aufweisen, wird die bloße Übersetzung einer klassischen Methode aber schnell aufwendiger als eine komplette Neuentwicklung, die dann auch gleich zeitgemäßere Resultate wie gesteigerter Schnelligkeit und verbesserter Auflösung (UHPLC-Methoden) erlaubt.
3.3.2 Selektierte Analyse einer unbekannten Verunreinigung – Lösemittelwechsel mittels Single-/Multi-Heartcut-Technologien
Je nach Aufgabe des Analytiklabors und der eingesetzten Verfahren ist es nicht immer erforderlich, eine bestehende HPLC-Methode vollständig MS-kompatibel anzupassen. Charakterisierungslabore, deren Hauptaufgabe in der Untersuchung und Bestimmung von unbekannten Verunreinigungen liegt, um damit z. B. die Entwicklung chemischer Synthesen oder Produktionsprozesse zu unterstützen, sei es in der In-Prozess-Kontrolle oder bei der Freigabeanalytik, müssen häufig nur eine bestimmte Substanz im Chromatogramm untersuchen, um dann, zum Beispiel mittels hochauflösender Exaktmassenmessung