HPLC optimal einsetzen. Группа авторов
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und Detergenzien vermeiden
• Puffer-/Additivkonzentrationen von ≤ 30 mmol/l anstreben
• Organikanteil während der Elution der Analyten von größer als 10–20 % und kleiner als 90–95 % anstreben
• Optimale Flussraten für ESI: 0,05–0,3 ml/min
• Optimale Flussraten für APCI: 0,3–1 ml/min
3.2.2 Optimierung der Ionenquellenbedingungen
Nach der Ausarbeitung der LC-Trennmethode gilt es, die Geräteparameter des Massenspektrometers so zu optimieren, dass eine möglichst empfindliche Detektion der Zielanalyten gewährleistet wird. Dieses sog. Tuning ist für jede HPLC-MS-Methode individuell verschieden und sollte nicht mit der Kalibrierung verwechselt werden, bei der mittels definierter Referenzstandards genau bekannter molarer Masse und ggf. des Fragmentierungsverhaltens der Massenanalysator sowie der Ionendetektor des Massenspektrometers kalibriert werden. Zum MS-Tuning infundiert man zweckmäßigerweise in einer Fließinjektionsanalyse (FIA) mittels einer Spritzenpumpe eine Lösung von Referenzstandards des bzw. der Zielanalyten kontinuierlich in die Ionenquelle und optimiert die MS-Quellen- und Ionentransfereinstellungen entsprechend. Alternativ kann auch in einer Serie von einzelnen Injektionen in den Eluentenstrom mithilfe des LC-Autosamplers, die dann zu dezidierten Peaks im MS-Chromatogramm führen, optimiert werden. Im Falle der FIA empfiehlt es sich, die Tuninglösung der Referenzstandards mit etwa einem Zehntel der später in der Analyse erwarteten Konzentration anzusetzen. Als Infusionslösemittel dient idealerweise die Fließmittelzusammensetzung zum Zeitpunkt der chromatographischen Elution der Substanzzone. Falls diese nicht (näherungsweise) bestimmt werden kann, tut es auch die über das Gradientenprogramm gemittelte Laufmittelzusammensetzung, was jedoch mit einer gewissen Abweichung des Detektionsergebnisses in der späteren Trennung im Vergleich zu dem Tuningergebnis einhergeht. Die Flussrate entspricht derjenigen, die auch in der LC-Trennung zur Anwendung kommt. Sollte diese so hoch sein, dass sie mit einer üblichen Spritzenpumpe nicht sinnvoll gefördert werden kann, kann das reine Fließmittel von der UHPLC-Pumpe gepumpt werden, während eine Spritzenpumpe vor der Ionenquelle die Tuninglösung in aufkonzentrierter Form über ein T-Stück in den Eluentenstrom einspeist. Im Online-Monitoring-Modus der LC-MS-Software optimiert man nun, sofern das Massenspektrometer keine automatisierte Tuning-Routine besitzt, schrittweise die Quellenparameter nacheinander so, dass man zunächst eine gleichförmige Basislinie ohne Stufen, Einbrüche oder Signalspitzen (Spikes) erhält – das ideale Zeichen für einen stabilen Sprayprozess. Den stärksten Einfluss auf die Spraystabilität haben die Gasfluss- und -druckeinstellungen bei pneumatisch unterstützter Vernebelung sowie die Trocknungstemperatur in der MS-Ionenquelle. Eine höhere Signalstärke erzielt man hingegen durch vermehrte (selektive) Ionenausbeute sowie einen verstärkten Transfer von Ionen aus dem Quellenbereich durch die Vakuumschleuse in den Ionentransferbereich des Massenspektrometers. Dies steuert man bevorzugt über die Hochspannung für das Elektrospray bei ESI bzw. bei APCI zusätzlich über die Ladungsdichte an der Koronarentladungsnadel sowie über die Beschleunigungsspannungen entlang des Ionentransferpfades in den Hochvakuumbereich. Leider sind die Quellenparameter nicht voneinander unabhängig. Eine mehrdimensionale Überprüfung der optimalen Einstellungen ist im Laboralltag aus Zeitgründen oft nicht möglich. Mit der hier beschriebenen Optimierungsreihenfolge kommt man in der Regel allerdings rasch zu einem stabilen und völlig ausreichenden Arbeitsbereich. Die Reihenfolge der Optimierungsparameter orientiert sich dabei an den physikalischen Abläufen, die zur Eluatentfernung und zum Ladungstransfer auf die Analyten führen: Trocknung des Eluats (Zerstäubung und Verdampfung, bestimmt durch Aerosolgröße, -eigenschaften und Temperatur) sowie Ladungsübertragung in der Gasphase. Davon ausgehend empfiehlt es sich, die Quelleneinstellungen in folgender Reihenfolge auf optimale Signalausbeute und minimiertes Rauschen hin zu optimieren; man beachte, dass je nach Gerätehersteller nicht alle Parameter an jedem Massenspektrometer zugänglich sind:
• Quellentemperatur; bei APCI: auch APCI-Heizblocktemperatur
• Druck des Vernebelungsgases
• Volumendurchsatz des Trocknungsgases
• Ionisierungsspannung; bei APCI: auch Koronarnadelstrom
• Transferkapillarspannung
Im Fall von nano-LC-Quellen und gelegentlich bei Ionenquellen für analytische Flussraten hat man auch die Möglichkeit, die räumliche Position der Sprayeinheit relativ zum Vakuumeinlass des Massenspektrometers sowie die Austrittslänge der Spraykapillare aus der Sprayeinheit zu optimieren. Erfahrungsgemäß hat dies bei nano-ESI-Quellen einen großen Einfluss auf die Signalqualität und -stärke, insbesondere auf die Ionenausbeute im Massenspektrometer, während die Werkseinstellung der Ionenquelle bei analytischen Flussraten kaum noch Optimierungspotenzial bietet. Da auch die Position der Spraykapillare in der Sprayeinheit die Ionenausbeute stark beeinflusst, wird eine regelmäßige Kontrolle des Sprayers auf korrekte Justage und mögliche Beschädigungen sehr empfohlen.
Es sei an dieser Stelle angemerkt, dass Massenspektrometer meist die Möglichkeit bieten, periodisch zwischen negativer und positiver Polarität hin- und herzuschalten, um in einem LC-MS-Lauf quasi-simultan kationisch und anionisch zu ladende Analytmoleküle zu detektieren. Für einen Screeninglauf, zum Beispiel innerhalb der Prozesskontrolle, kann dies ein nützliches Werkzeug sein, das es erlaubt, einen zusätzlichen LC-MS-Lauf einzusparen. Allerdings sind die Möglichkeiten dieses Verfahrens begrenzt: Zum einen ist die zu erwartende Ausbeute an „alternativ geladenen“ Analytionen in der Regel recht gering. LC-MS-Läufe werden meist an den Rändern des pH-Bereichs durchgeführt, z. B. ameisensauer oder ammoniakalisch. Bei pH-Werten unter 2,5 oder über 9 werden nur noch stark saure oder basische Verbindungen überhaupt als Ion im entgegengesetzt geladenen Modus detektiert. Zum anderen muss nicht allein die Polarität der Ionenquelle, sondern die des gesamten Ionenpfades im Massenspektrometer zyklisch umgepolt werden. Je nach MS-Bautyp vergehen dabei Sekunden, bis das Gerät stabilisiert ist, in denen das Massenspektrometer aber blind ist für Analytmoleküle und keine Daten aufzeichnet. Sollte das jeweilige LC-MS-System solche Moduswechsel flink genug unterstützen, ist dies eine reizvolle Zusatzoption für Screening-Experimente. Solide Quantifizierungen sollten allerdings der höheren Robustheit wegen stets in einem Modus durchgeführt werden.
Empfehlungen
• Lösen der Probe im LC-Laufmittel – Konzentration soll ca. 1/10 der Konzentration der injizierten Probe betragen
• Direkte Infusion bei der Flussrate, die später in der LC-Trennung angewandt wird
• Einstellung der Gasflüsse und Trocknungstemperatur (bei APCI zusätzlich: APCI- Heizblocktemperatur) für ein stabiles Spray (im Routinefall eher selten nötig: Einstellung der ESI-Spraykapillarposition)
• Optimierung der Ionisierungsspannung (ESI/APCI; bei APCI zusätzlich: Koronarnadelstrom): höhere Spannung führt zu größerer Ionenausbeute, jenseits eines Optimums Gefahr der Glimmentladung und Probenfragmentierung
• Optimierung der Spannung der Ionentransferkapillare: höhere Spannung erhöht die Zahl an Ionen im Massenanalysator, jenseits eines Optimums jedoch Anstieg von Fragmentbildung durch exzessive Kollision mit Restgasmolekülen (In-Source-Fragmentation)
3.2.3 Optimierung der MS-Detektion
Nach der erfolgreichen Optimierung der Ionenquelleneinstellungen, die die höchste Ausbeute an gewünschten Ionenaddukten zum Ziel hat, steht als nächstes die Einstellung des Massenselektors und -detektors auf höchste Empfindlichkeit an. Die genauen Einstellparameter variieren dabei je nach Bautyp des Massenspektrometers und nach Hersteller. Allen gemein ist die Aufgabe der elektrischen Optik im Mittel- und Hochvakuumbereich des Massenspektrometers. Vor dem eigentlichen Massenanalysator befindet sich eine Ionenoptik, die zwei Ziele verfolgt: die möglichst vollständige Abtrennung von Neutralmolekülen, Lösemittelresten und Restgas sowie die konvergente Bündelung des Analytionenstrahls. Die Ionenoptik besteht meist aus